通過(guò)直接從冷凍瓶接種抗體生產(chǎn)生物反應(yīng)器來(lái)強(qiáng)化工藝

通過(guò)工藝強(qiáng)化，有幾種方法可以使抗體生產(chǎn)過(guò)程更高效、更便宜。在本研究中，使用超高細(xì)胞密度工作細(xì)胞庫(kù)將來(lái)自冷凍管的細(xì)胞直接接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)之后，成功進(jìn)行了補(bǔ)料分批中試規(guī)模實(shí)驗(yàn)作為概念驗(yàn)證。此外，細(xì)胞以 2L 規(guī)模在灌注模式下培養(yǎng)。這里介紹的強(qiáng)化方法可以消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器外的接種物生產(chǎn)，并通過(guò)節(jié)省時(shí)間和空間來(lái)創(chuàng)造額外的生產(chǎn)能力。與補(bǔ)料分批模式相比，在灌注模式下，生物反應(yīng)器生產(chǎn)率可提高 180% 以上。

關(guān)鍵詞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、補(bǔ)料分批、灌注、1:10 調(diào)節(jié)比、超高細(xì)胞密度冷凍管

1  介紹

盡管在最近的新冠疫情期間疫苗的批準(zhǔn)和生產(chǎn)激增，單克隆抗體 (mAb) 仍然是最重要的生物制藥，仍然占生物制藥銷(xiāo)售額和新批準(zhǔn)生物制藥的 50% 以上。這些抗體大多用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞生產(chǎn)，主要用于治療炎癥和自身免疫性疾病以及癌癥 。

由于這對(duì)生物制藥制造商的重要性，近年來(lái) mAb 生產(chǎn)工藝的改進(jìn)一直是關(guān)注的焦點(diǎn)，目的是降低生產(chǎn)成本并實(shí)現(xiàn)更高的生物反應(yīng)器生產(chǎn)率和制造能力。該工藝強(qiáng)化應(yīng)用于上游和下游操作。在上游工藝中，強(qiáng)化的重點(diǎn)有三個(gè)領(lǐng)域：i. 細(xì)胞庫(kù)，ii. 接種物生產(chǎn)，以及 iii. 抗體生產(chǎn)工藝。建立高細(xì)胞密度或大容量細(xì)胞庫(kù)以改進(jìn)細(xì)胞冷凍工藝的方法已被多個(gè)研究小組描述。

在這里，通過(guò)在冷凍管中冷凍高達(dá) 260 × 106 細(xì)胞 mL–1 的細(xì)胞密度 [11] 或在冷凍袋中冷凍高達(dá) 150 mL 的體積 ，可以實(shí)現(xiàn)每個(gè)冷凍單位的大量細(xì)胞，這反過(guò)來(lái)又可以使解凍后搖瓶中的細(xì)胞膨脹變得過(guò)時(shí)。

為了進(jìn)一步強(qiáng)化種子培養(yǎng)，N-1 灌注是一種選擇。在這里，種子培養(yǎng)的最后一步是在灌注模式下進(jìn)行的，目標(biāo)是活細(xì)胞密度 (VCD) 高達(dá) 200 ×106 細(xì)胞 mL–1，以便隨后接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器 [7, 12–15]。強(qiáng)化細(xì)胞庫(kù)和 N-1 灌注相結(jié)合用于一步接種物生產(chǎn)已經(jīng)成功實(shí)施 [6,10,15]。

例如，可以通過(guò)高接種量補(bǔ)料分批生產(chǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn) mAb 生產(chǎn)工藝的強(qiáng)化，即在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中接種高起始 VCD，以縮短生產(chǎn)過(guò)程并實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)量 。作為補(bǔ)料分批工藝的替代方案，近年來(lái)，連續(xù)生產(chǎn)工藝的趨勢(shì)已變得明顯。這些灌注工藝的優(yōu)勢(shì)在于，可以在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)以恒定的濃度和質(zhì)量收獲產(chǎn)品，從而簡(jiǎn)化了下游流程。近年來(lái)，一次性領(lǐng)域的新發(fā)展使得連續(xù)生產(chǎn)工藝在上游和下游領(lǐng)域都變得更容易、更安全。借助現(xiàn)代細(xì)胞系、培養(yǎng)基和一次性設(shè)備，與補(bǔ)料分批工藝相比，灌注工藝可以實(shí)現(xiàn)更高的時(shí)空產(chǎn)量。即使在傳統(tǒng)上被稱(chēng)為中試規(guī)模而非生產(chǎn)規(guī)模的生物反應(yīng)器中，可實(shí)現(xiàn)的生產(chǎn)率 > 1gL–1d–1，也使得能夠同時(shí)生產(chǎn)與以補(bǔ)料分批模式運(yùn)行的立方米規(guī)模一次性生物反應(yīng)器相當(dāng)數(shù)量的抗體。此外，由于占地面積較小，可以同時(shí)運(yùn)行多個(gè)較小的生產(chǎn)生物反應(yīng)器。例如，BiosanaPharma 擁有一種處于臨床 III 期的奧馬珠單抗生物仿制藥，該藥以 50L 生物反應(yīng)器規(guī)模生產(chǎn)，計(jì)劃成為第一個(gè)以連續(xù)生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的抗體 [30]。

在強(qiáng)化 mAb 生產(chǎn)工藝時(shí)，還應(yīng)考慮產(chǎn)品質(zhì)量。工藝變化會(huì)影響質(zhì)量參數(shù)。經(jīng)常分析的參數(shù)是糖基化模式、抗體電荷變體的比例以及碎片和聚集體的比例 [31–35]。其中一些參數(shù)是關(guān)鍵質(zhì)量屬性，即它們可能對(duì)生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性或安全性產(chǎn)生重大影響。在功能測(cè)定和臨床研究中，應(yīng)逐個(gè)抗體研究關(guān)鍵質(zhì)量屬性 。

在之前的研究中，描述了一個(gè) > 250×106 細(xì)胞 mL–1 的細(xì)胞庫(kù)的建立 [11]。隨后，該細(xì)胞庫(kù)被用于在實(shí)驗(yàn)室和中試規(guī)模中成功實(shí)現(xiàn)低種子和高種子補(bǔ)料分批工藝的一步接種物生產(chǎn) [15]。本研究旨在通過(guò)消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器之前的所有種子培養(yǎng)步驟來(lái)進(jìn)一步強(qiáng)化上游工藝。為此，補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)以及灌注生物反應(yīng)器直接接種來(lái)自超高細(xì)胞密度工作細(xì)胞庫(kù) (UHCD-WCB) 冷凍管的細(xì)胞（圖 1）。在中試規(guī)模中，使用 HyPerforma DynaDrive S.U.B. 生物反應(yīng)器 (Thermo Scientific) 的高調(diào)節(jié)比，在 50L 生物反應(yīng)器中僅接種 5L 工作體積。這種方法可以大大簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，因?yàn)榻臃N物生產(chǎn)不再需要基礎(chǔ)設(shè)施和生物反應(yīng)器，并且可以將手動(dòng)操作減少到限度。

2 材料和方法

2.1 細(xì)胞系和培養(yǎng)基

在所有培養(yǎng)中，均使用產(chǎn)生免疫球蛋白 G (IgG) 的 ExpiCHO-S 細(xì)胞系 (Gibco)。對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，使用 Efficient-Pro 培養(yǎng)基 (Gibco) 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用 Efficient-Pro Feed 2 (Gibco) 作為補(bǔ)料溶液。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了 6mmolL–1 L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich) 和 0.1% 抗凝劑 (Gibco)。灌注培養(yǎng)使用添加了 4mmolL–1 L-谷氨酰胺和 0.1% 抗凝劑的高強(qiáng)度灌注 CHO 培養(yǎng)基 (Gibco)。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)使用 0.66x 濃縮培養(yǎng)基，灌注時(shí)使用 1x 濃縮培養(yǎng)基。

圖 1. 使用 UHCD-WCB 進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的示意圖。

2.2 接種物生產(chǎn)

根據(jù) Muller 等人描述的步驟，在搖瓶（Corning）中在 7 天內(nèi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)。在沒(méi)有種子培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自 UHCD-WCB 的冷凍保存細(xì)胞（VCD 為 260 ×106 細(xì)胞 mL–1）解凍，然后直接轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)系統(tǒng)中（50L 培養(yǎng)，使用裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移瓶）或在搖瓶中以 1:10 的比例稀釋?zhuān)⒓尤腩A(yù)熱培養(yǎng)基（搖瓶和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器）。測(cè)定 VCD 后，將必要量的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的培養(yǎng)系統(tǒng)中。

2.3補(bǔ)料分批模式下的 IgG 生產(chǎn)

在三種不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行了補(bǔ)料分批模式的 IgG 生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)：(i) 250mL 一次性搖瓶（康寧），最大工作體積為 54mL；(ii) Ambr 250 模塊化容器（哺乳動(dòng)物版，兩個(gè) 3 葉片段攪拌器，Sartorius），最大工作體積為 250mL；(iii) 50L HyPerforma DynaDrive S.U.B.（賽多利斯），帶有梯形攪拌器組件，該組件帶有三個(gè) 2 斜葉片攪拌器和一個(gè) 2 葉片掃掠攪拌器，最大工作體積為 50L（圖 1）。

在第一階段，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)（搖瓶）與直接接種 UHCDWCB 的冷凍保存細(xì)胞（搖瓶和 Ambr 250）進(jìn)行了比較。對(duì)于這些補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)，接種細(xì)胞密度為 0.2–0.3 × 106 細(xì)胞 mL–1。在標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的初始批次階段 3 天后，以及將冷凍保存的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)系統(tǒng) 4 天后，開(kāi)始每日補(bǔ)料程序。取樣后，每天以當(dāng)前工作體積 2vol% 的劑量添加補(bǔ)料培養(yǎng)基，總共 12 天。為了將培養(yǎng)系統(tǒng)中的葡萄糖濃度保持在 2gL–1 以上，在需要時(shí)添加 450gL–1 葡萄糖溶液。

在第二階段，將強(qiáng)化補(bǔ)料分批培養(yǎng)程序（不進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)）轉(zhuǎn)移到 50L 中試規(guī)模。在這里，解凍一個(gè) 4.5mL 的 UHCD-WCB 冷凍管，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到起始體積為 5L 的 DynaDrive 生物反應(yīng)器中。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，在第 2 天到第 6 天之間，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將工作體積線性增加至 38L，以達(dá)到補(bǔ)料分批工藝的起始體積。作為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的縮小比較，同時(shí)啟動(dòng)一個(gè) Ambr 容器，接種相同的接種物，每天進(jìn)行相同的稀釋以模擬體積膨脹，這意味著 Ambr 以 100mL 的最小工作體積啟動(dòng)，并且在稀釋的第一天必須從生物反應(yīng)器中取出部分細(xì)胞懸浮液，以達(dá)到與 DynaDrive 相同的稀釋率。從第 7 天開(kāi)始，在 12 天內(nèi)每天以 2vol% 的工作體積進(jìn)行推注喂養(yǎng)。

搖瓶在 37℃、8% CO2、80% 相對(duì)濕度和 150min-1 搖動(dòng)速度（搖動(dòng)幅度 50mm）的搖動(dòng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 Ambr 和 DynaDrive 中的培養(yǎng)采用恒定比功率輸入 40Wm–3、37℃、0.1vvm 覆蓋通氣、pH ≤ 7.2 和溶解氧 (DO) ≥ 40% 進(jìn)行。pH 和 DO 設(shè)定點(diǎn)通過(guò)通入 CO2 或 O2 進(jìn)行控制。兩個(gè)系統(tǒng)均自動(dòng)添加 1:10 稀釋的消泡劑 C (Sigma-Aldrich) 溶液。DynaDrive 生物反應(yīng)器由 G3Pro 控制器 (Thermo Scientific) 控制。

2.4 灌注模式下的 IgG 生產(chǎn)

灌注模式培養(yǎng)在配備兩個(gè) 3 葉段式攪拌器的 3L HyPerforma 玻璃生物反應(yīng)器（Thermo Scientific）中進(jìn)行。使用 G3Lab 控制器（Thermo Scientific）作為控制單元。培養(yǎng)在 37℃、0.1vvm 覆蓋通氣和 165Wm–3 的恒定比功率輸入下進(jìn)行。通過(guò)噴射器添加 CO2 或 O2 來(lái)控制 pH ≤ 7.2 和 DO ≥ 40%。生物反應(yīng)器接種來(lái)自一個(gè) 4.5mL UHCD-WCB 冷凍管的細(xì)胞。灌注模式在培養(yǎng)的第 2 天開(kāi)始。根據(jù)細(xì)胞密度，每天調(diào)整一次灌注率，以保持細(xì)胞比灌注率高于 55pLcell–1d–1，直到達(dá)到 1.0d–1 的灌注率。在 23 天內(nèi)保持恒定。隨后，將接下來(lái) 12 天的灌注率增加到 1.5d–1，將最后 18 天的灌注率增加到 2.0d–1。為了將生物反應(yīng)器的體積保持在 2L 不變，收獲泵由生物反應(yīng)器的重量控制。細(xì)胞保留由 suATF2（Repligen）和 XCell Lab 控制器（Repligen）實(shí)現(xiàn)。平均流速為 0.9Lmin–1。為了將活細(xì)胞體積 (VCV) 保持在不同的設(shè)定點(diǎn)不變，用電容探頭（Incyte Arc、Hamilton Bonaduz）控制排氣泵。為了將葡萄糖濃度保持在 2gL–1，添加了 450gL–1 葡萄糖溶液。為此，使用了 CITSens MeMo 葡萄糖探頭（梅特勒-托利多有限公司，C-CIT 傳感器）。

2.5 分析

每天一次對(duì)補(bǔ)料分批和灌注實(shí)驗(yàn)進(jìn)行取樣，并使用 Cedex HiRes 分析儀（Roche Diagnostics）分析細(xì)胞特異性參數(shù) VCD、總細(xì)胞密度、活力和細(xì)胞直徑。使用 Cedex Bio 分析儀（Roche Diagnostics）測(cè)定底物葡萄糖和谷氨酰胺以及代謝物乳酸和銨以及產(chǎn)物 IgG 的濃度。

根據(jù) N-糖基化、電荷變體以及抗體的低分子和高分子種類(lèi)的比例分析抗體質(zhì)量。使用 Protein A 樹(shù)脂純化后，使用親水相互作用超高效液相色譜分析聚糖，使用陽(yáng)離子交換高效液相色譜分析電荷變體，并使用尺寸排阻色譜分析抗體的低分子和高分子種類(lèi)

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)

在搖瓶中分別進(jìn)行了三次補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)接種生產(chǎn)，并直接從搖瓶和 Ambr 生物反應(yīng)器中的冷凍管中接種。強(qiáng)化工藝中的接種細(xì)胞密度為 0.20 ± 0.02×106 細(xì)胞 mL–1 (SF_int) 和 0.21 ± 0.01 ×106 細(xì)胞 mL–1 (AM_int)，而參考搖瓶中的接種細(xì)胞密度為 0.28 ± 0.03 × 106 細(xì)胞 mL–1 (SF_sta，圖 2a)。正如我們之前的研究 [11,15] 中所見(jiàn)，強(qiáng)化過(guò)程中第一天的生長(zhǎng)率比參考實(shí)驗(yàn)（SF_sta，0.038 ± 0.005h–1）低 45%，而 AM_int 為 0.017 ± 0.003h–1，SF_int 為 0.017 ± 0.005h–1，指數(shù)期偏移了大約一天。因此，飼料從第 4 天開(kāi)始，而不是第 3 天。我們之前的實(shí)驗(yàn)和其他團(tuán)隊(duì)已經(jīng)描述了滯后階段和培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)活力的輕微下降 [4, 8, 10, 11, 15]。

參考實(shí)驗(yàn)中的最大 VCD 為 18.5 ± 0.9 × 106 細(xì)胞 mL–1，在第 6 天達(dá)到，在一天后的強(qiáng)化過(guò)程中，VCD 為 16.8 ± 1.1 × 106 細(xì)胞 mL–1（SF_int）和 13.9 ± 0.4 × 106 細(xì)胞 mL–1（AM_int）。在所有實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞活力一直保持在 90% 以上，直到培養(yǎng)結(jié)束（圖 2a）。最大 VCD 不同的原因可能是細(xì)胞在添加四到五次飼料后進(jìn)入穩(wěn)定期。如果此時(shí) VCD 較低，則不會(huì)進(jìn)一步增加。因此，較低的最大 VCD 值可以歸因于之前的生長(zhǎng)。由于第一次喂食時(shí) VCD 較低（SF_int 為 3.4 ± 0.4 × 106 細(xì)胞 mL–1，AM_int 為 3.2 ± 0.3×106 細(xì)胞 mL–1，而 SF_sta 為 4.4±0.5 × 106 細(xì)胞 mL–1），且 ambr 實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)率在第 6 天和第 7 天之間保持較低（0.014 ± 0.002h–1，而 SF_int 為 0.019 ± 0.003h–1），因此最大 VCD 保持較低。

盡管如此，IgG 產(chǎn)生的過(guò)程是可比的。根據(jù)生長(zhǎng)的時(shí)間變化，IgG 的產(chǎn)生也偏移了一天（圖 2b）。收獲時(shí)，可達(dá)到相當(dāng)?shù)淖畲?IgG 滴度 3.71 ± 0.14gL–1 (SF_sta)、3.57 ± 0.07gL–1 (SF_int) 和 3.65 ± 0.03gL–1 (AM_int)。這些滴度與先前研究中描述的滴度相似 [15]。細(xì)胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的曲線沒(méi)有顯示相關(guān)偏差，可在支持信息 (SI；圖 S1) 中找到。結(jié)果表明，UHCD-WCB 可以消除實(shí)驗(yàn)室規(guī)模補(bǔ)料分批工藝對(duì)接種物生產(chǎn)的需要。

根據(jù)各種屬性分析了抗體質(zhì)量。N-糖基化中 G0F 聚糖的比例在 82 ± 1% (SF_int 和 AM_int) 和 84 ± 2% (SF_sta) 之間，第二高的比例是 G1F (SI 圖 S4a)。這種糖基化模式很有前景，因?yàn)槿祟?lèi) IgG 在體內(nèi)主要以 G0F、G1F 和 G2F 的形式存在 [34]。所有實(shí)驗(yàn)中的電荷變體也相似，主峰約為 40%，酸性和堿性變體各約為 30%（SI 圖 S4b）。碎片和聚集體的比例很低，單體比例在 93 ± 1%（SF_sta）和 94 ± 1%（SF_int 和 AM_int）之間（SI 圖 S4c）。這些結(jié)果表明，使用 UHCD-WCB 對(duì)抗體質(zhì)量參數(shù)沒(méi)有影響

圖 2. 在搖瓶 (SF) 和 Ambr (AM) 中以標(biāo)準(zhǔn) (sta) 和強(qiáng)化 (int) 接種物生產(chǎn)進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)期間，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) IgG 濃度的時(shí)間過(guò)程。所有實(shí)驗(yàn)的 N = 3。

3.2概念驗(yàn)證中試規(guī)模補(bǔ)料分批生產(chǎn)

然而，對(duì)行業(yè)來(lái)說(shuō)更有趣的當(dāng)然是 UHCD-WCB 在更大規(guī)模上開(kāi)辟的可能性。由于 DynaDrive 的生物反應(yīng)器概念使得僅使用 5L 的起始體積即可工作，因此 50L 生物反應(yīng)器以 0.18 × 106 細(xì)胞 mL–1 開(kāi)始，僅使用一個(gè) 4.5mL 的冷凍管進(jìn)行接種（見(jiàn)第 2.3 節(jié)）。由于第 2 天和第 6 天之間的連續(xù)稀釋?zhuān)▓D 3b），VCD 在第 4 天之前保持在 1.0 × 106 細(xì)胞 mL–1 以下，在第 6 天之前保持在 3.0 × 106 細(xì)胞 mL–1 以下，無(wú)論是在 DynaDrive 中還是在平行 Ambr 中（圖 3a）。在第一天的滯后期之后直到第 7 天第一次補(bǔ)料，生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增生長(zhǎng)呈指數(shù)增長(zhǎng)。在第 11 天達(dá)到最大 VCD 17.0 × 106 細(xì)胞 mL–1（Ambr：14.7×106 細(xì)胞 mL–1）之后，DynaDrive 中的細(xì)胞存活率在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)緩慢下降至 85%，而在 Ambr 中，收獲時(shí)細(xì)胞存活率仍超過(guò) 95%（圖 3a）。盡管如此，在整個(gè)補(bǔ)料分批階段，DynaDrive 中的 VCD 仍然高于 Ambr。存活率較低很可能是因?yàn)樵?Ambr 中，一些死細(xì)胞被泡沫從懸浮液中漂浮出來(lái)并粘附在生物反應(yīng)器壁和其他生物反應(yīng)器元件上，由于工作體積幾乎恒定，它們一直留在那里（圖 3b）。另一方面，在 DynaDrive 中，粘附在生物反應(yīng)器壁上的細(xì)胞會(huì)隨著反應(yīng)器體積的增加而再次懸浮，因此在取樣過(guò)程中也會(huì)被檢測(cè)到。與其他實(shí)驗(yàn)相比，這兩個(gè)生物反應(yīng)器在第 8 天之后的生長(zhǎng)減緩是不典型的，并導(dǎo)致最大 VCD 相對(duì)較低。

在補(bǔ)料階段（從第 7 天到第 19 天），兩個(gè)系統(tǒng)的每日特異性 IgG 生成率 qIgG 相當(dāng)（圖 4b），22.2 ± 5.2 pg 細(xì)胞/天（DynaDrive）和 22.0 ± 6.2pg 細(xì)胞/天（Ambr），并且達(dá)到了相似的 IgG 濃度。經(jīng)過(guò) 19 天的實(shí)驗(yàn)，在 DynaDrive 中收獲了 3.58gL-1 IgG，在 Ambr 中收獲了 3.49gL-1（圖 4a），與第 3.1 節(jié)中的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料分批的結(jié)果和之前的結(jié)果相當(dāng) [15]。細(xì)胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的曲線沒(méi)有顯示相關(guān)偏差，可以在支持信息中找到（圖 S2）。兩個(gè)補(bǔ)料分批工藝結(jié)束時(shí)的抗體質(zhì)量在所有屬性上與第 3.1 節(jié)中的實(shí)驗(yàn)相當(dāng)，并且無(wú)法確定調(diào)整工藝的影響（SI 圖 S4）。這些結(jié)果表明，綜合起來(lái)，UHCD-WCB 和高調(diào)節(jié)比的生物反應(yīng)器可以消除所有小于 50L 的生物反應(yīng)器，從而節(jié)省空間、時(shí)間和勞動(dòng)力。

3.3 概念驗(yàn)證 2 L 灌注

在補(bǔ)料分批生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中，用 UHCD-WCB 冷凍管中的細(xì)胞接種顯示出良好的結(jié)果，然而 mAb 生產(chǎn)的趨勢(shì)越來(lái)越傾向于灌注。因此，2L 生物反應(yīng)器接種了一個(gè)冷凍管中的細(xì)胞，并在灌注模式下使用 suATF2 進(jìn)行操作。在 57 天的培養(yǎng)期內(nèi)測(cè)試了四種不同的 VCV 和灌注率設(shè)置，以確定 VCV 特異性抗體生產(chǎn)率和體積生產(chǎn)率最高且細(xì)胞活力不會(huì)下降太快的 VCV 特異性灌注率范圍（表 1、圖 5a）。

圖 3. 在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，a) VCD 和活力 (Viab) 和 b) 生物反應(yīng)器體積的時(shí)間過(guò)程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強(qiáng)化 (int) 接種物生產(chǎn)作為縮小參考 (ref)。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的 N = 1。

圖 4. 在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中，a) IgG 濃度和 b) 特定 IgG 生成率 qIgG 的時(shí)間過(guò)程，以 DynaDrive (DD) 和 Ambr (AM) 中的強(qiáng)化 (int) 接種物生產(chǎn)作為縮小參考 (ref)。所有實(shí)驗(yàn)的 N = 1。

在第一階段提供 31 μL mm–3d–1的 VCV 特定灌注率并在最后階段提供 41 μL mm–3d–1 時(shí)，細(xì)胞存活率高于 97%，但在第二和第三階段，存活率依次下降，分別為 22 和 24 μL mm–3d–1，在第 40 天降至 87%（圖 5b）。

隨著存活率的下降，細(xì)胞生長(zhǎng)也隨之下降，因此出血率也隨之下降，反之亦然（圖 6）。在兩個(gè)高存活率階段，出血率約為 0.50d–1，在第 21 至 27 天之間僅為 0.21 ± 0.07d–1，在第 29 至 38 天之間甚至僅為 0.15 ± 0.06d–1。為了盡可能減少因失血而造成的產(chǎn)品損失，我們的目標(biāo)是盡可能降低細(xì)胞生長(zhǎng)速度 [38]。但與此同時(shí)，細(xì)胞存活率也不能下降太多，因?yàn)檫@可能會(huì)降低 mAb 質(zhì)量，增加細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)的積累，而這些碎片和蛋白質(zhì)在一定程度上會(huì)被 ATF 截留。本研究關(guān)于失血率和存活率變化的結(jié)果表明，該細(xì)胞系和培養(yǎng)基的最佳 VCV 特異性灌注率為 25 至 30μL/mm–3d–1

表 1. 灌注率、目標(biāo) VCV 和達(dá)到的 VCV。

這些結(jié)果也得到了產(chǎn)品形成的支持。在第 21 至 27 天之間的階段，生物反應(yīng)器和收獲物中的 IgG 濃度達(dá)到最高（圖 7a）。隨后 VCV 設(shè)定點(diǎn)和灌注率的增加再次導(dǎo)致 IgG 濃度降低，但體積生產(chǎn)率（根據(jù) ATF 下游收獲的 IgG 量相對(duì)于生物反應(yīng)器體積計(jì)算）從 0.50 ± 0.07gL–1d–1（d21-d27）增加到 0.73 ± 0.05gL-1d-1（d29-d40）（圖 7b）。相比之下，在存活率和生長(zhǎng)率較高的階段，只能收獲 0.19 ± 0.04gL–1d-–1（d6-d18）和 0.29 ± 0.07gL–1d–1（d50-d57）。這不僅是因?yàn)槌鲅瘦^高，還因?yàn)榇穗A段細(xì)胞的 IgG 產(chǎn)物形成率 qIgG 較低（圖 7b）。體積生產(chǎn)率是灌注過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)。現(xiàn)代工藝在 1.0–1.3d–1 的灌注率下可實(shí)現(xiàn)約 1gL–1d–1 的生產(chǎn)率[22,23]。然而，這些過(guò)程中使用的是 CHO K1 細(xì)胞，在如此低的灌注率下，其 VCV 可以生長(zhǎng)到 100mm3mL-1 以上，因此，與本研究中的 VCV 特定生產(chǎn)率相當(dāng)，足以實(shí)現(xiàn)比本研究中使用的 CHO-S 細(xì)胞高得多的生產(chǎn)率。

細(xì)胞直徑、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和銨的進(jìn)程可以在支持信息中找到（圖 S3）。在四個(gè)目標(biāo)穩(wěn)態(tài)（第 15 天、第 25 天、第 35 天和第 55 天）中的每一天分析抗體質(zhì)量。盡管與補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)相比，糖基化模式和批次變體的分布有所不同，但在灌注實(shí)驗(yàn)期間，所有質(zhì)量屬性均保持不變，表明產(chǎn)品質(zhì)量恒定，盡管在過(guò)程中設(shè)置了不同的參數(shù)（SI 圖 S5）。

圖 5. 2L 灌注培養(yǎng)期間 a) 灌注率和 VCD，以及 b) 灌注率和活力的時(shí)間過(guò)程（N = 1）。

圖 6. 2L 灌注培養(yǎng)過(guò)程中灌注率和失血率的時(shí)間過(guò)程（N = 1）。

4 Conclusions 結(jié)論

在之前的研究中，研究了已建立的 UHCD-WCB 在批量模式下的生長(zhǎng)和生產(chǎn)行為 [11]，并實(shí)現(xiàn)了一步接種生產(chǎn) [15]，本研究的結(jié)果表明，以及如何消除生產(chǎn)生物反應(yīng)器外的接種生產(chǎn)。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)中，直接從 UHCD-WCB 冷凍管接種的工藝與標(biāo)準(zhǔn)工藝僅在一天的滯后階段有所不同。隨后，生長(zhǎng)和生產(chǎn)都具有可比性（第 3.1 節(jié)）。

對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程，中試規(guī)模的良好結(jié)果更令人感興趣（第 3.2 節(jié)）。僅用一個(gè)凍存管就成功接種了 5L 工作體積的 DynaDrive，一方面表明使用 UHCD-WCB 并直接在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中擴(kuò)增細(xì)胞可以取代 10 天的標(biāo)準(zhǔn)接種物生產(chǎn)，僅需額外 4 天的擴(kuò)增時(shí)間，節(jié)省 60% 的時(shí)間；另一方面，揭示了立方米規(guī)模的補(bǔ)料分批工藝的兩種可能性：(i) 50L 生物反應(yīng)器可用一個(gè)小瓶接種，可在批量或灌注模式下作為 N-1 步驟操作，可用作一次性生產(chǎn)規(guī)模的低種子或高種子補(bǔ)料分批培養(yǎng)的接種物，甚至可以在不銹鋼生物反應(yīng)器中達(dá)到兩位數(shù)的立方米規(guī)模；(ii) 通過(guò)在 UHCD 范圍內(nèi)的 150mL 冷凍袋中冷凍 WCB，可以成功接種起始體積為 250L 的 5m3 DynaDrive 生物反應(yīng)器。

此外，UHCD-WCB 還用于概念驗(yàn)證灌注實(shí)驗(yàn)（第 3.3 節(jié)）。所得結(jié)果表明，優(yōu)化工藝可使生產(chǎn)率達(dá)到約 0.7gL-1d-1 IgG（基于生物反應(yīng)器體積），持續(xù)數(shù)周或數(shù)月。因此，除去工藝開(kāi)始時(shí)的非生產(chǎn)性生長(zhǎng)階段，在灌注模式下，在 15 天內(nèi)可收獲 10.5gL-1 IgG，而補(bǔ)料分批模式下則可收獲約 3.7gL-1 IgG，多出 180%。灌注結(jié)果可轉(zhuǎn)移到中試和生產(chǎn)規(guī)模，類(lèi)似于補(bǔ)料分批結(jié)果。由于 CHO K1 細(xì)胞在灌注過(guò)程中比本研究中使用的 CHO-S 細(xì)胞具有更高的生產(chǎn)率，因此在 UHCD 范圍內(nèi)冷凍產(chǎn)生 mAb 的 CHO K1 細(xì)胞系并使用 DynaDrive 生物反應(yīng)器可以實(shí)現(xiàn) 50 L 規(guī)模的高產(chǎn)生產(chǎn)過(guò)程，其中不需要外部種子培養(yǎng)

圖 7. a) 生物反應(yīng)器和收獲物中的 IgG 濃度和 IgG 保留率的時(shí)間過(guò)程，以及 b) 2L 灌注培養(yǎng) (N = 1) 期間生產(chǎn)率和細(xì)胞體積特定 IgG 生產(chǎn)率 qIgG。

據(jù)作者所知，這項(xiàng)研究展示了在補(bǔ)料分批和灌注模式下直接接種來(lái)自冷凍管的細(xì)胞到生產(chǎn)生物反應(yīng)器。由于 DynaDrive 生物反應(yīng)器的調(diào)節(jié)比為 1:10，因此能夠僅用來(lái)自一個(gè) 4.5 毫升冷凍管的細(xì)胞接種 50L 生物反應(yīng)器，并直接在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中進(jìn)行整個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增。所示結(jié)果使得在生產(chǎn)工廠中可以只使用生產(chǎn)生物反應(yīng)器，或者如果需要，只使用額外的 N-1 生物反應(yīng)器。可以省略 N-1 之前的任何培養(yǎng)以及幾乎所有的手動(dòng)處理步驟，從而減少所需的勞動(dòng)力、時(shí)間和空間，并降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

縮寫(xiě)詞

CHO      Chinese hamster ovary 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢

DO         Dissolved oxygen 溶解氧

IgG         Immunoglobulin G 免疫球蛋白G

mAb       Monoclonal antibody 單克隆抗體

UHCD    Ultra-high cell density  超高細(xì)胞密度

VCD       Viable cell density 活細(xì)胞密度

VCV      Viable cell volume 活細(xì)胞體積

WCB     Working cell bank 工作細(xì)胞庫(kù)